Nattfiol er en opp til tre desimeter høy orkidé. De to nedre bladene er avlange til elliptiske, og er nesten motsatte i plassering. Bladene høyere opp på stengelen (2-5 stk.) er mye mindre, og er linje- og lansettformede.

Planten blomstrer i juni-juli med hvite, velduftende blomster med svakt grønnskjær samlet i et bredt, opprett aks Blomsterleppen er 8-12 mm lang, linjeformet og hengende.

Som så mange andre orkidéarter, er også nattfiols blomster konstruert for å lokke til seg helt spesialiserte pollinatorer, i dette tilfellet nattsvermere. Dette kan ses på blomstersporen som er hele 25-30 mm lang. Kun et insekt med lang proboscis (snabel) er i stand til å finne fram til nektaren som er gjemt helt i bunnen av sporen. Derfor dufter også nattfiol mye sterkere om kvelden; for at nattsvermerne skal kunne finne fram til planten og pollinere den.

Planten vokser i åpne skoger, kratt, enger, fuktige heier og på sidlent mark, da helst på kalkrik jord. Nattfiol er forholdsvis vanlig i Sør-Norge, men finnes spredt nord til Finnmark.